当前位置:茶沃网 > 生活 > 种草 > 手把手教你完成质粒DNA提取实验

手把手教你完成质粒DNA提取实验

发布时间: 茶叶定制 浏览

9278002-ab2d065ec6aa3dd3.jpg

质粒DNA经常用于我们的细胞实验。现在使用试剂盒非常方便。此外,在细胞培养后,可以浓缩和提取多个管。上述质粒量大,可在-20℃保存。后来,它可用于酶消化、转化等实验。凝胶可以预先运行。只要不降解,就可以连续使用。没有必要每次都使用,必须再次培养和提取。

质粒DNA的提取

质粒主要是双链环状的DNA分子,是独立于细菌染色体的复制和遗传的辅助遗传单位。质粒是分子生物学实验和基因工程改良物种最重要的DNA载体。

实验步骤

1.振荡栽培

1)将测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板上。

2)置于37℃恒温培养箱中,培养12-17h,培养菌落。

3)向灭菌后的15毫升离心管中加入5毫升含抗生素的液体培养基,并编号。

4)选择单克隆细菌,放置液体培养基,在每个培养基中放置一个菌落。

5)在37℃和180rpm下振荡培养过夜。

2.收获细菌并裂解

1)将扩增的细菌溶液离心,根据说明重新悬浮细菌溶液,并将其转移到1.5毫升离心管中。

2)按照说明使用质粒微量提取试剂盒提取质粒。

3)将细菌高速离心1分钟以完全去除上清液。

4)加入250微升铷溶液,振荡器完全悬浮细菌。

5)添加250微升溶液。立即上下翻转10次,让细菌溶解,在室温下放置2分钟。

6)加入250ulNB溶液。立即上下翻转10次,使其完全中和。在室温下放置2分钟。

7)室温,1500rpm,高速离心15分钟。

8)将吸附柱放入收集管中,在室温下以15000转/分的速度高速将离心所得的上清液转移至吸附柱中30s。

9)弃去废液,将吸附柱放入收集管,向吸附柱中加入700微升WB溶液,以15000转/分的速度高速离心30s。

10)重复前面的操作。

11)将吸附柱置于1.5毫升的干净离心管中,加入30-50微升预热的洗脱缓冲液,室温放置2分钟,高速离心1分钟。

12)样品的电泳检测:1%琼脂糖凝胶电泳,样品加载量为2ul,在紫外灯下观察,最亮的条带为超螺旋形式,这在一定程度上可以表明提取质粒的纯度。

3.质粒的纯化

1)将之前提取的质粒放入1.5毫升离心管中,并加入1/10体积的3毫升/升无菌乙酸钠溶液。

2)加入2倍体积的无水乙醇,在-20℃下静置沉淀4-6小时或过夜。

3)4℃,高速离心机14000rpm,离心机20min。

4)弃去上清液,用70%乙醇洗涤两次。

5)风干,可放在干净的工作台上晾干。

6)加入200微升无菌水溶液干燥沉淀物,得到质粒溶液。

7)用紫外分光光度计测定质粒的浓度和产量。

测定OD260和OD280的值:质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数(μg/mL)。

10个常见问题

I .时间控制问题

裂解时间过长,加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟;吸附时间不足;溶解时间不足将导致质粒DNA提取实验失败。

二。大肠杆菌的老化

建议在涂布平板培养后重新选择新的菌落进行液体培养。

3.质粒拷贝数低

由于使用低拷贝数载体导致质粒DNA提取量低,具有相同特定功能的高拷贝数载体可以被替代。

四.溶液使用不当

当温度较低时,P2和P3的解决方案可能会变得混浊。它们应该在37℃下保持一段时间,直到它们在使用前溶解成透明溶液。

V.吸附柱过载

不同产品的吸附柱吸附能力不同。如果要提取的质粒量大,请提取几次。如果使用富集培养基,如结核杆菌或YT菌液,则必须减少体积;如果质粒或宿主细菌具有非常高的拷贝数或生长率,则需要调节LB培养液的体积。

6.质粒并不复杂

DNA只能在低盐溶液中洗脱。洗脱效率取决于酸碱度。最大洗脱效率在pH 7.0和8.5之间。用水洗脱时,确保其酸碱度在此范围内。如果酸碱值太低,可能会导致低洗脱量。将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃进行洗脱,有利于提高洗脱效率。

X.洗脱体积太小

洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增加,回收率增加,但产物浓度降低。为了获得更高的回收率,可以增加洗脱体积。

技术咨询热线:18702955082(微信同号)